大连海洋大学研究生，大连海洋大学研究生院
生物活性肽（BAP）是指具有多种生物学功能、对机体有益的肽类化合物，其活性功能与氨基酸排列组成、肽链长度、电荷特性和空间结构等密切相关。现已涌现出电泳技术、膜分离技术和色谱技术等多种分离活性肽的方法。 BAP的分子结构复杂、性质各异，目前单一模式色谱分离难以实现精准分离。 混合模式色谱（MMC） 由于具有多重保留机制，在分离活性肽样品时具有高负载、高分辨率和独特的选择性，在活性肽精准分离方面展现出高度的应用潜力。
大连海洋大学食品科学与工程学院 马月云、张丹丹、周慧*等 人 从不同模式的视角出发，对现有的MMC固定相以及在BAP分离领域的应用进行梳理和总结，以期为基于MMC的BAP的研究和应用提供参考。
1.基于RPLC/IEC的目标肽分离方法
目前研究者多在基质二氧化硅的表面进行改性，表1总结了目前常见的RPLC/IEC固定相。RPLC/IEC在活性肽的应用中通常采用含盐有机溶液作为分离流动相，利用肽的亲疏水性、电荷特性对多肽混合物进行分离鉴定。因其分离条件对多肽的生物活性影响较小，已广泛应用于BAP的分离纯化。该分离模式固定相的制备多采用“硫醇-烯”点击化学（click chemistry）的方法，点击化学是Sharpless提出的一种合成方法，其核心是通过小单元的拼接进行较大分子的化学合成，具有产率高、副产物无害、反应有很强的立体选择性和反应条件简单等特点。周珊珊等首先在二氧化硅微球表面键合半胱氨酸（Cys），然后通过异氰酸十八酯与Cys上氨基反应键合具有疏水作用的十八烷基，获得反相/弱阳离子交换MMC填料，其中ODS基团发挥反相分离作用，Cys的羧基基团发挥离子交换分离作用。通过对AGSNDANAEFVGK等6 条疏水性和理论等电点（pI）不同的标准肽段混合物进行分离，发现该色谱材料除了具有良好的分离效果，对于疏水性质相似的肽段，也能够通过pI实现特异分离。与此同时，Wang Jianzhong等对Cys和乙烯基功能化硅胶采用类似方法制备Cys-silica固定相，再使用溴代烷烃（溴乙烷、1-溴辛烷和1-溴十八烷）在Cys氨基处进行季铵化反应修饰，得到了功能化固定相（Cys-silica-Cn，n＝2、8和18）（图1）。使用疏水的溴代烷烃对Cyssilica进行季铵化，提高了蛋白质分离的选择性和分离效率。以5 mmol/L KH2PO4-水溶液为流动相A、体积分数50%乙腈-水溶液（含有1.0 mol/L NaClO4＋5 mmol/L KH2PO4）为流动相B，利用Cys-silica-C2柱或Cys-silica-C8柱在pH 8.0条件下可以实现肌红蛋白和核糖核酸酶B等6 种碱性蛋白质的基线分离，利用Cys-silica-C2柱在pH 4.0也可以实现卵清蛋白和α-乳清蛋白等5 种酸性蛋白质的完全分离。采用胺类基团对烷基链进行改性也是制备RPLC/IEC色谱固定相的手段之一。Acclaim Trinity P1色谱材料就是将末端采用叔胺基改性的烷基链键合在二氧化硅（孔径300 Å）表面制备得到的，其中叔胺基提供离子交换作用，烷基链提供反相作用，因此该色谱柱同时具有疏水和离子交换双重保留机制。在温和的酸性条件下使用该色谱柱梯度分离串联质谱标签（tandem mass tags，TMT）标记的蛋白质酶解肽，发现可分离分析超过8 700 种蛋白质。分析可能因为TMT提供了疏水性以及待分离物中Arg和Lys残基为肽添加了正电荷，提高了分离效率。
RPLC/IEC因反相和离子交换双重保留机制同时存在，对具有疏水性质、含离子或可解离的活性肽有较好的分离效果。通过调整不同改性基团的键合比例，可精准控制固定相结构和色谱分离性能。该色谱分离模式具有分离效率高、分离效果好等特点，可实现活性肽的低成本、高效率分离。但由于流动相多为含盐溶液，分离样品仍需要进行进一步的除盐纯化。另外，由于该模式缺乏亲水作用保留机制，对亲水性肽的特异性分离效果较差。
2.基于RPLC/HILIC的目标肽分离方法
RPLC/HILIC是将烷基等疏水性基团、酰胺基等亲水性基团同时固定在色谱材料表面，疏水基团发挥疏水作用，亲水基团表面与有机溶液的流动相之间形成富水层发挥亲水作用，从而使疏水与亲水两种保留机制同时存在，利用活性肽组成氨基酸的不同亲疏水性，实现目标物的有效分离。表2总结了部分常见的RPLC/HILIC固定相。
RPLC/HILIC对活性肽的分离纯化主要是利用组成氨基酸的不同亲疏水性。对于化学性质极端的疏水/亲水性多肽物质，RPLC模式的分离解析能力已经无法全覆盖，因此需要其他模式色谱与其协同使用。该MMC目前广泛应用于分离鉴定药品中核苷、植物提取物或环境中的碳氢化合物（多环芳烃）等，对活性肽的分离纯化尚处于初步探索阶段。Montone等将具有反相作用的ODS柱和亲水相互作用的多孔石墨碳（PGC）柱结合，获得了反相-亲水串联色谱柱。将该色谱柱应用于牛奶中活性肽的分离纯化，以水和乙腈（均含体积分数0.1% TFA）分别作为流动相A和B，最终获得了26 种活性肽，其中包括先出峰的亲水肽（Pro-Gly-Phe-Pro）和随后出峰的疏水肽（Pro-Val-Ala）等。通过氨基酸序列分析，发现该色谱材料能够对亮氨酸和异亮氨酸进行特异性识别分离，并且对于亲水性短肽的保留率达25%，对疏水性短肽的保留率为51%。Sommella等开发了一种HILIChRP耦合色谱，将微藻肽首先通过亚乙基桥联酰胺杂化颗粒（ethylenehybrid amide，BEH amide）亲水相互作用色谱柱，再进入BIOshell ES-C18 Peptide反相色谱柱（图2），共检测到VAVGVGK、GLVGADAGK等184 种藻蓝蛋白衍生肽，表明所开发的二维色谱模式在微藻肽分析中具有良好的应用潜力。
RPLC/HILIC可以在同一固定相上同时分离亲/疏水性活性肽，实现了更高的保留范围和更大的峰值容量，克服了对极性与非极性的混合肽分离不完全的困难，增强了对复杂样品的分离高效性，具有分离时间短、效率高和能够特异性识别分离的优点，与复杂样品具有更高的适配性。但是，由于HILIC和RPLC使用的溶剂强度差别较大，导致谱带展宽、峰值失真等不良现象，因此在分离过程中需要选择合适的流动相，以发挥两者的协同优势。
3.基于HILIC/IEC的目标肽分离方法
HILIC/IEC是通过点击化学、表面引发原子转移自由基聚合技术等手段，将具有亲水性质的基团与具有离子交换作用的基团键合在同一基质表面，并基于亲水、离子交换双重保留机制，实现对亲水性和电荷特性不同的BAP分离。目前常见的HILIC/IEC如表3所示。
HILIC/IEC利用部分活性多肽具有的亲水性和电荷特性，在分离过程中将离子相互作用和亲水相互作用等协同作用于分析肽，进而实现对混合物的分离纯化。该固定相的制备多采用“硫醇-烯”点击化学方法，例如Click TE-GSH色谱柱是将含有巯基的GSH固定在乙烯基二氧化硅上，以获得HILIC/IEC。GSH由谷氨酸、Cys和甘氨酸组成，是一种具有良好亲水性的天然两性离子寡肽化合物，其谷氨酸残基N-端氨基发挥亲水作用，甘氨酸残基C-末端游离的羧基在pH 3.0～6.5范围内显示出表面负电荷，发挥阳离子交换作用。Shen Aijin等使用该色谱固定相可实现对电荷不同的标准肽（KRQYKSILQEENRR、NRAESFRQLWDGARK、GFGRYRRHGSPW等）的高效分离，疏水肽较亲水肽洗脱时间更短。然后将该固定相应用于人血清白蛋白胰蛋白酶消化物的分离，获得了86 个肽85%的序列覆盖率，进一步证实了该固定相在肽分离纯化方面的多功能性和应用广泛性。水合良好的离子可以选择性地增强带电物质的保留，如Cui Yusi等将具有良好水合性的Mg 2＋ 加入静电排斥-亲水相互作用色谱（ERLIC）中，Mg 2＋ 有助于低pH值下负电荷官能团和负电荷肽的保留（图3）。对小鼠皮层胰蛋白酶解物进行色谱分离发现，当ERLIC中的Na ＋ 或NH 4＋ 被水合良好的Mg 2＋ 取代时，带有负电荷基团的肽（例如磷酸肽）的保留率和选择性成倍增加，梯度洗脱可得到富含磷酸、6-磷酸甘露糖和 N -/ O -连接聚糖的肽级分。流动相组成显著影响HILIC/IEC对活性肽的保留。Kozlik等研究开发了含硅胶的HILIC-A和含氨基丙基的HILIC-B两种色谱柱，结果表明在不同pH值（甲酸铵：pH 2.1/3.5；乙酸铵：pH 5.5）和缓冲液浓度环境下，两种色谱柱均具有亲水和离子交换作用。色谱保留性能研究发现，以乙腈＋50 mmol/L甲酸铵缓冲液作为流动相时，由于带负电荷的硅烷醇静电相互作用增加，带正电荷的Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys和Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH 2 的保留性能随HILIC-A柱的pH值增加而增加。此外，研究发现静电相互作用的比例越高，肽的峰形越差。例如亮氨酸脑啡肽、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met和血管紧张素I、II的峰对称性随着HILIC-B柱上缓冲液浓度的增加而改善。
HILIC/IEC在分离过程中将亲水作用和静电作用相结合，通过与固定相键合的混合配体识别和分离活性肽，弥补了IEC分离效率低和HILIC洗脱条件严格等缺点，显示出更高的分离选择性。多重相互作用的存在不仅解决了色谱峰形差等问题，而且提高了分离效率，在复杂生物样品肽分离中具有较大的应用潜力。
4.基于RPLC/HILIC/IEC的目标肽分离方法
由于混合多肽的复杂性和多样性，为了同时分离疏水性相近的酸性、碱性、中性多肽，需要固定相同时具有阴/阳离子交换、亲/疏水的多重保留机理。RPLC/HILIC/IEC固定相将具有亲水、疏水和离子交换3 种作用的基团键合（表4），在色谱中同时具有3 种分离机理，成为目前的研究热点。
RPLC/HILIC/IEC同时具有3 种分离机制，可以实现复杂样品的高效分离。近年来，对于该新型MMC的研究成果层出不穷，如Lämmerhofer等开发了一种基于二氧化硅基质的带有极性基团的烷基链和末端弱阴离子交换型奎宁环的RPLC/HILIC/IEC色谱分离材料，其中烷基链中烷烃发挥疏水作用，所带的极性基团（硫醚和酰胺基）发挥亲水作用，末端奎宁环提供弱阴离子交换位点。通过对人血管活性肠肽（hVIP）研究发现，该色谱柱可以根据溶质的性质和色谱条件在不同模式下使用，在流动相构成为A：水、B：乙腈、C：200 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 3.0）条件下，可选择性识别亲疏水性和pI不同的Gly-Asp、Gly-Gly-Ala和Phe-Arg-Arg等肽段。新型开管毛细管电色谱柱（MMC-OT-CEC）采用毛细管柱替代常用的不锈钢柱，将苯乙烯、甲基丙烯酸、N-[2-(丙烯酰氨基)苯基]丙烯酰胺（N-[2-(acrylamido) phenyl]acrylamide，N2-APA）单体，利用可逆加成-断裂转移技术键合到基质上。研究发现该色谱柱在流动相为乙腈/20 mmol/L甲酸铵缓冲溶液（70∶30，V/V，pH 6.5）时，可从牛细胞色素c的胰蛋白酶消化蛋白样品中分离出23 种多肽，并观察到率先洗脱出峰的是亲水肽。同时对6 种商业肽（Trp-Gly、Thr-Tyr-Ser、Pro-Phe-Gly-Lys、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Phe-Leu-Glu-Glu-Ile和Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr）分离效果良好，每柱理论塔板数接近2 000 000。另外，不同分离机制色谱柱的联用也是分离活性肽的手段之一。3D-LC/Q-Orbitrap-MS和3D HILIC-SCX-RP/PGC LC均为新建立的多色谱联用平台，其中3D HILIC-SCX-RP/PGC LC用于分析酿酒酵母的总裂解物，共识别到19%蛋白质和24%肽，该联用平台在复杂样品食蟹猴血浆的N-糖蛋白分析中成功得到122 个N-聚糖和135 个N-糖基化位点，首次证实了38 个含N-乙醇酰神经氨酸的N-聚糖的存在（图4）。
RPLC/HILIC/IEC与双分离模式固定相相比，具有三重保留机理，在分离中具有更高的灵活性，并且可以通过调整提供不同作用力基团的修饰比例、流动相组成实现对色谱柱的性能调控。但是目前研究主要集中在新型色谱固定相材料的合成，应用则集中在脂质、核苷和碱基等物质。对于分离BAP，主要用于肽段的识别以阐明色谱固定相的保留机制，对复杂活性肽样品的分离纯化仍处于探索阶段。
结语
BAP来源的复杂性及分子结构的多样性，为其高效分离带来巨大挑战。MMC可根据分离对象不同的物理化学性质，在固定相基质表面键合特定的基团，通过调节不同基团的修饰量、改变分离环境条件，提高色谱柱对不同结构活性肽的分离效率。在活性肽的分离过程中，不同类型的MMC具有各自的适用肽特点及优缺点（表5）。整体而言，MMC在活性肽分离过程中，具有分离效率高、效果好、可特异性识别和灵活性高等特点，与复杂样品具有更高的适配性。
然而，基于MMC分离BAP领域目前依然存在一些技术难题：第一，混合色谱固定相材料的修饰基团选择范围广泛，修饰基团的确定和分离效果常通过实验优化，分离材料合成步骤复杂、产率低、重复性较差；第二，随着使用次数的增加，色谱材料的分离效率会有所降低，材料缺乏耐久性；第三，不同性质的活性肽在同时分离时，之间产生的相互影响造成色谱峰形较差，导致分离效果不佳。为解决上述问题，首先，应对活性肽的结构特性进行详细解析，探索适宜的基团修饰，对不同参数进行优化，研发多功能的色谱填料。其次，选择耐用的基材与牢固的键合手段，尽量减小分离物质对色谱材料的损耗。再次，选择合适的MMC色谱柱对活性肽进行分离，通过控制分离环境减小对峰形的不良影响。此外，寻找通用的技术理论指导也极为重要，不仅需要通过理论和实验双重支持对流动相进行合理选择，以提高混合模式间的协同作用，还需要大量的实验探索总结MMC分离BAP的通用技术理论，指导活性肽实现精准分离。
BAP的分离与人体健康息息相关，其精准分离能够促进食品、药品等相关领域的发展。MMC为精准分离活性肽提供了新的技术方案。为开发MMC在活性肽领域的应用潜力，需要借助不同领域的新材料、新手段，寻找探索更实用的多功能化色谱材料，以有效提高对复杂样品的适配度，更好实现活性肽的高产率、高效率、低成本分离，扩展现代高效液相色谱分离技术在食品科学、精准医学、中药、分子生物学等领域的应用范围。
本文《基于混合模式色谱生物活性肽的分离研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷第9期185-193页，作者：马月云，张丹丹，李盈柔，刘梦琪，吕瑞，刘苗苗，任丹丹，武龙，汪秋宽，周慧。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220428-372。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：渤海大学食品科学与工程学院 王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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大连海洋大学研究生(大连海洋大学研究生院)