流式管，流式管规格
众所周知，成就一次完美的多色流式，从成功的配色开始。不管是实验小白还是资深科研党，都难免在流式配色上翻过车。
今天，丁香实验联合伊莱瑞特给大家带来一堂生动的流式配色课堂，仅需 4 步，成就完美多色流式！
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在正式讲解流式配色方案之前，如果还不太了解流式细胞术配色的基本原则，以及如何设置对照实验，可以先戳下方文字学习收藏哦。
01：根据实验目的，选择目标 Marker
通过阅读相关文献，了解实验需要的 Marker，以及这些 Marker 之间的逻辑关系。
这里给大家列举了一些常见的细胞标志Marker：
02：确认 Marker 的表达位置
对于细胞质或者细胞核的 Marker，需要对细胞进行固定破膜 / 破核膜。
在做胞质或胞核 Marker 染色实验操作时，需要先染细胞表面 Marker，再对细胞进行固定破膜，最后对胞内或核内 Marker 染色。
此时细胞表面的 Marker 尽量避免使用串联染料，因为「固定」容易对串联荧光素造成影响。
（图片来源于：Elabscience）
一般来说，绝大部分 CD 分子指标，都是细胞表面指标，IL 白介系列、IFN-γ、TNF-α 等，属于胞内指标，而最常见的核内染色指标是 Foxp3。
确认 Marker 表达位置的同时，我们还需要了解 Marker 的表达量。，我们需要通过表达量的强弱，来搭配荧光素的弱强。
通常，根据待测细胞类型中，相应抗原的表达量，可以粗略地将抗原分子分为三类：
01
很容易鉴定、容易区分阴阳性细胞群、阴阳性峰明显分开的抗原。例如: CD3，CD4，CD19 等。
02
很容易鉴定、较高水平表达、经常连续性表达。例如: CD27，CD28，CD45RA, CD45RO 等。
03
低水平表达、激活性 Marker、未知但关键。例如: CD25，STAT5，Foxp3 等。
（图片来源于：Elabscience）
表达量的强弱，可以参考厂家的质检结果，但更多地需要参考文献里具体细胞群体的表达。
03：了解所用流式细胞仪的配置信息
流式细胞仪是同时检测多种荧光的，这些荧光之间可能存在干扰。我们需要根据流式细胞仪的通道，来确认有哪些荧光素可以选择，这样可以在后期搭配的时候，尽量避免干扰。
如果没有仪器的通道信息，是无法去确定哪些荧光素可供选择的。可以说，如果没有仪器通道信息，配色就是「无源之水，无本之木」。
通过仪器通道信息，确认可以选择哪些荧光素后，我们还需要了解荧光素的信息，确认这些荧光素的激发波长和发射波长、接收该荧光的滤光片等信息，是否和流式细胞仪的通道一致。
▲ 常见荧光基团信息，
（图片来源于：Elabscience）
流式细胞仪是同时检测多种荧光的，这些荧光之间可能存在干扰。我们需要根据流式细胞仪的通道，来确认有哪些荧光素可以选择，这样可以在后期搭配的时候，尽量避免干扰。
04：了解荧光素的强度
下表列出了常见荧光素的强度：
（图片来源于：Elabscience）
在已确定 Marker 的强弱，和流式细胞仪可检测的荧光素的强弱后，我们要遵循「强弱搭配原则」，进行配色。
强表达抗原，可以选择弱荧光素，也可以选择强荧光素。
如下图所示，强表达抗原 CD3，选择弱荧光素 FITC 或强荧光素 APC，对实验结果影响不大。
（图片来源于：Elabscience）
弱表达抗原，一定要选择强荧光素。
如下图所示，弱表达的抗原 CD25，选择弱荧光素 PerCP，会导致阴阳性细胞群分不开。如果选择强荧光素 PE，可以看到明显的阳性细胞群。
（图片来源于：Elabscience）
当然，在配色时，也会遇到一些其他的问题，如：细胞样本有自发荧光、细胞处理容易出现死细胞（需要额外增加死活细胞染料）等。因此，我们需要特别注意，将对应通道的荧光检测信息，预留给自发荧光，或者死活染料检测。
相信在了解了流式配色的基本原则及操作步骤后，大家的实验也能更加顺利地开展啦~
配色是一个需要多因素考虑的工作，如果在配色过程中还有其他问题，可以提交到丁香实验的问答广场上，我们特别请到了伊莱瑞特的专家团们，对大家发布的流式实验问题，进行解答，得到解决方案的同时，还能领取科研周边礼品哦
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来源｜Elabscience
流式管(流式管规格)